除草剂是解决作物田间杂草问题的有效方式，然而长期使用单一除草剂会加速杂草抗性的产生，从而加重杂草治理的难度。培育多种除草剂抗性作物并配合交替施用不同除草剂是该问题的解决之道。
今天，我们来看一看拜耳作物科学公司开发的一款双抗除草剂棉花GHB811。
1 修饰的性状
异噁唑草酮属于对羟基苯基丙酮酸酯双氧化酶（HPPD）抑制剂，可以破坏叶绿素的形成，导致受害杂草失绿枯萎，现在主要用于玉米、甘蔗等旱作物田做土壤处理的一种有机杂环类选择性内吸型苗前除草剂。异噁唑草酮主要经由杂草幼根吸收传导，药效持续时间长，受土壤墒情影响小，农药毒性低。这些优势使得异噁唑草酮除草剂具有很好的市场前景。异噁唑草酮＋草甘膦的除草剂使用组合将解决因长期施用草甘膦而产生的抗性杂草问题，为田间杂草的综合治理提供新的解决方案。
拜耳作物科学公司分别使用双位点突变的玉米epsps基因（2mepsps）和单位点突变的荧光假单胞菌hppd基因（hppdPf W336）赋予作物对草甘膦和异噁唑草酮除草剂的耐受性。
2mepsps基因编码一个双位点突变的EPSPS蛋白（T102I和P106S），突变体蛋白与草甘膦的结合性更弱但是依然可以行使EPSPS蛋白的功能。hppdPf W336基因编码一个单位点突变的HPPD蛋白（G336W），该位点是除草剂在HPPD蛋白上的重要结合位点，突变后同样影响了与除草剂的结合。因此，表达2mEPSPS和HPPD W336蛋白的作物能够耐受草甘膦和HPPD抑制剂类（如异噁唑草酮）除草剂。
利用这两个外源基因，拜耳公司已开发出抗除草剂草甘膦和异噁唑草酮的转基因大豆FG72。该转化体自2012年首批在美国、加拿大、澳大利亚、新西兰获得食用和/或饲用及种植的批准以来，至今已获得包括中国在内的17个国家和地区的批准。
2 转化体的开发过程及特征
GHB811转化体开发使用的质粒载体是pTSIH09，除了含有目的基因2mepsps和hppdPf W336外，还包含拟南芥中的H4启动子、组蛋白H4基因终止子，木薯花叶病毒启动子，玉米和向日葵中的RuBisCO小亚基信号肽序列等元件。表达载体通过农杆菌介导的方法转入陆地棉Coker312中，得到转基因棉花GHB811。
为了证明外源插入片段在转化体上的整合情况和拷贝数，研发人使用了10种不同的限制性内切酶和12条探针序列进行Southern杂交检测。结果显示，T-DNA片段完整、稳定地以单位点单拷贝的形式插入棉花基因组，且基因组不含有其他载体骨架序列，插入位点分析表明，T-DNA的插入造成棉花基因组上13 bp碱基的缺失。
目标性状的评价和目标蛋白的表达模式分析在美国主要棉产区的6个试验地进行。评价结果表明，GHB811可以耐受104.9～106.6 g a.i./hm2剂量的异噁唑草酮和1,104～1,123 g a.i./hm2剂量的草甘膦。目标蛋白的含量分析结果表明，植物中表达的蛋白含量极度小于小鼠经口急性毒性试验中使用的蛋白含量。
为评估新表达蛋白的安全性，研究者利用细菌生产了大量的外源蛋白，并通过从表观分子量、免疫原性、糖基化修饰、一级结构、酶活性等几个方面证明了细菌表达蛋白和植物表达蛋白的实质等同性。GHB811中的2mEPSPS蛋白的表观分子量为47.7 kDa，可以被特异性的抗体杂交出信号，无糖基化修饰，测定的氨基酸序列可以覆盖理论序列的95.5%，包括一个大小为47.285 kDa（去蛋氨酸）的成熟蛋白和一个大小为47.551 kDa的引导肽切除不完全的蛋白，酶活性达到2.451 U/mg。GHB811中的HPPD蛋白的表观分子量为40.3 kDa，可以被特异性的抗体杂交出信号，无糖基化修饰，测定的氨基酸序列可以覆盖理论序列的98.6%，包括一个大小为40.180 kDa（去蛋氨酸）的成熟蛋白和一个大小为40.447 kDa（去蛋氨酸）的引导肽切除不完全的蛋白。
相对于2mEPSPS，HPPD W336蛋白是较新应用于商业化开发的除草剂抗性蛋白。HPPD W336蛋白序列与已知的致敏原和毒蛋白没有同源性，只有一个已知毒蛋白溶血素与其有序列相似性，但是体外试验表明，HPPD W336蛋白并没有溶血活性。此外，HPPD W336蛋白在体外模拟胃液中可以被快速降解，这些都初步证明了该蛋白的食用安全性。此外，HPPD W336和野生型HPPD蛋白的底物谱也是相同的，因此蛋白在植物中不会引发任何代谢变化。
对转基因棉花种子（除草剂处理和不处理）和非转基因对照棉花的主要成分分析结果表明，处理和不处理的转基因棉花中的水分、蛋白、脂肪、纤维素、氨基酸、抗营养因子、脂肪酸、矿物质和生育酚等54个分析项目中有43个项目与对照没有显著差异，其余11个项目虽然与对照有差异，但是仍然在参考值的范围内。
环境安全性的试验包括了棉花的综合农艺性状评价，空气、水、土壤等外部环境的影响评价，动植物和土壤微生物种群变化分析，生物多样性影响分析，基因漂移和杂草化趋势分析，抗性杂草管理策略，对人和动物的健康影响以及其他社会影响评估。结果均表明相对于对照而言，GHB811不会对环境造成有害的影响。
3 上市前的准备
2018年，双抗除草剂棉花GHB811已获得了美国、加拿大、澳大利亚、新西兰、日本政府的食用许可，并获得了美国的饲用和种植许可。
注：美国农业部（USDA）、环境保护署局（EPA）和食品药品监督管理局（FDA）是转基因作物的主要管理部门。USDA主要从管理有害生物保护农业的角度确保转基因作物的安全种植，对环境没有不利影响。EPA只负责与农药特征相关的转基因生物的安全评价及管理，主要涉及植物内置式杀虫剂（plant incorporated protectant，PIP）、抗除草剂转基因作物和转基因微生物农药。对于抗除草剂转基因作物，EPA主要考察其对除草剂的抗性效果，并要求申请者与除草剂生产者合作对除草剂的农药标识做出新用途修订。FDA负责转基因生物食品、饲料的营养和安全咨询。食品安全办公室或兽药中心关于转基因植物类食品、饲料销售前的最终咨询，也称为生物技术产品的上市通知。
由于公司间的兼并重组，GHB811已划归巴斯夫种业公司所有，因此FDA后期的申报咨询主体为巴斯夫。
4 产权保护情况
拜耳公司通过构建专利群的形式保护其产品。这些专利从多个角度对与产品相关的创新进行保护，包括保护HPPD抑制剂类除草剂可能的抗性蛋白、除草剂复配剂型（US 10159249），具有HPPD抑制剂抗性的植物（EP 2012/075903），具有HPPD活性的各种蛋白组成、氨基酸残基和位点（US 2015/019610、EP 2016/071159），GHB811转化体及检测方法（EP 2017/059096、WO/2017/182420）等。 （莱肯生物）
农药快讯, 2019 (3): 6-7.
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