农药登记中急性毒性试验方法汇总
作者:陈亚丽 更新时间:2019-12-06 点击量:992

  在农药登记申请资料中,毒理学中的急性毒性试验在对农药进行安全性评价时是必不可少的,急性毒性试验不仅为农药急性毒性的强弱提供依据,也为其他毒理学试验剂量设置提供参考价值。

本文简述了急性毒性试验中的急性经口试验、急性经皮试验、急性吸入试验、眼刺激性及腐蚀性试验、皮肤刺激性及腐蚀性试验、皮肤变态反应(致敏)试验。

 

急性经口毒性试验

1.1  定义

  急性经口毒性(Acute oral toxicity):机体1次或在24 h内多次经口给予受试物后,动物在短期内出现的健康损害效应。

 

  半数致死剂量(Median lethal dose,LD50):在规定时间内,能引起试验动物总体中半数死亡的剂量。以实验动物单位体重接受受试物的质量表示(mg/kg)。

 

1.2  试验目的

  (1)评估受试物毒性,为急性毒性分级提供依据;

 

  (2)通过短时间经口染毒,初步评价毒物的毒性特征和剂量-反应关系;

 

  (3)为其他毒理学试验剂量的选择提供依据;

 

  (4)便于标签的管理。

 

1.3  试验方法

  (1)序贯法(Up and down procedure,UDP)

  序贯法是一个阶梯式的染毒程序。使用单一性别的动物,一次染毒一只。第一只动物的染毒剂量最好低于LD50的估计值。后续动物染毒剂量的增减取决于前一只动物的染毒结果(存活或死亡)。

 

  在不能获得受试物LD50的初步估计值及剂量-反应关系时,计算机模拟结果提示起始剂量可选择175 mg/kg,采用0.5的反对数(对应于一个默认的剂量级数因子3.2)计算剂量间距。以最大似然法计算LD50的点估计值和95%可信区间。

 

  (2)受试物

  受试物可配置成水溶液、油溶液或悬浮液。

 

  (3)试验动物

  可选用鼠龄在8~10周内的SD大鼠或Wistar大鼠,单一性别,通常采用雌性动物。

 

  (4)染毒操作

  染毒操作由限量试验和正式试验组成。限量试验染毒剂量为5 000 mg/kg,最多使用5只动物。正式试验的起始剂量在无法得到受试物致死剂量的估计值时,可默认为175 mg/kg。

 

  所设定的剂量序列为:1.75、5.5、17.5、55、175、555、2 000 mg/kg,或者是1.75、5.5、175、55、175、555、1 750、5 000 mg/kg。

 

  一次染毒一只动物,每只动物的染毒间隔时间为48 h。第二只动物染毒剂量取决于第一只动物的染毒结果,如动物死亡或呈濒死状态,剂量下调;如动物存活,剂量上调。

 

  当后续剂量出现与起始剂量相反的染毒结果时,追加4只动物序贯染毒后结束试验,或当达到任一终止试验的规定时,可结束试验。动物数大约6~9只。

 

1.4  观察指标

  在染毒后24 h以及14 d的观察期内,每天定时观察并详细记录每只动物的中毒反应。

 

  观察内容要包括:中枢神经系统和神经肌肉系统、植物神经系统、呼吸系统、泌尿生殖系统、皮肤和被毛、消化系统和眼,以及体重的称量(染毒前、染毒后和处死前)与毒理学检查。

 

急性经皮毒性

2.1  定义

  急性经皮毒性(Acute dermal toxicity):机体连续接触24 h经皮肤染毒受试物,所产生的健康损害效应。

 

  半数致死剂量(Median lethal dose,LD50):在规定时间内,能引起实验动物总体中半数死亡的剂量。以实验动物单位体重接受受试物的质量表示(mg/kg)。

 

2.2  试验目的

  (1)评估受试物对实验动物所产生的毒性,为急性毒性分级提供依据;

 

  (2)初步了解受试物能否经皮肤吸收和毒性作用模式;

 

  (3)为其他毒理学试验剂量的选择提供依据;

 

  (4)便于标签的管理。

 

2.3  试验方法

  试验前去除试验动物受试部位的被毛,将试验动物至少分成3组,每组涂不同剂量的受试物,然后观察试验动物中毒反应和死亡情况,对试验中死亡和试验结束时处死的动物应做大体解剖,计算LD50和95%可信区间。

 

  (1)受试物

  液态受试物一般使用原液;固态受试物应将其研磨成粉状过100目筛,并用水等介质充分湿润。

 

  (2)试验动物

  首选最敏感的性别体重在200~300 g的大鼠,也可选用体重在2.0~3.0 kg的白色家兔或体重在350~450 g的豚鼠。

 

  (3)染毒操作

  限量试验一次染毒两种性别各5只动物,染毒剂量为2 000 mg/kg或5 000 mg/kg。

 

  试验前24 h,在动物背部正中线两侧去毛,染毒面积不应少于试验动物体表面积的10%,将受试物均匀涂布于试验动物的去毛区,覆盖一层不渗透材料后再以2~8层的多孔纱布覆盖,并用无刺激胶布或绷带加以固定,接触24 h后取下固定物和覆盖物,用温水或适当的方法清除皮肤上残留的受试物。至少设3个剂量组,每个剂量组不少于5只。

 

2.4  观察指标

  每天观察一次,连续14 d,不超过21 d,观察内容至少包括:中枢神经系统和神经肌肉系统、植物神经系统、呼吸系统、泌尿生殖系统、皮肤和被毛、消化系统和眼,以及体重的称量(染毒前、染毒后和处死前)与毒理学检查。

 

急性吸入毒性

3.1  定义

  急性吸入毒性(Acute inhalation toxicity):机体在短时间内(24 h或24 h之内)一次连续吸入较高浓度的受试物(气体、蒸汽、气溶胶或颗粒状物)出现的健康损害效应。

 

  半数致死剂量(Median lethal dose,LC50):在规定时间内,经呼吸道一次连续吸入受试物后,能引起试验动物总体中半数死亡的剂量。以单位体积空气中受试物的质量表示(mg/m3)。

 

3.2  试验目的

  (1)评估受试物对实验动物所产生的毒性,为急性吸入毒性分级提供依据;

 

  (2)为其他毒理学研究提供科学的参考资料;

 

  (3)为制定生产和应用过程中的防护措施提供依据;

 

  (4)便于标签的管理。

 

3.3  试验方法

  采用机械通风装置,连续不断地将含有一定浓度受试物的空气均匀地送入染毒柜,换气量大约为12~15次/h,维持相对稳定的染毒浓度。

 

  采用全身暴露或头、鼻部暴露方式对动物进行持续4 h的急性吸入。如果采用动物全身暴露的染毒方式,为确保染毒柜内空气稳定,应当注意使试验动物的总体积不超过染毒柜体积的5%。

 

  (1)受试物

  受试物应采用制备工艺稳定、符合质量标准规定的样品,注明名称、来源、批号、含量、保存条件、配置方法和检验报告。

 

  (2)试验动物

  首选8~10周的健康大鼠,体重差异不得超过同性别体重的±20%。正式试验之前,动物应在试验环境中检疫、适应3~5 d时间,饲养条件应符合《实验动物 环境及设施》(GB14925)的有关规定。

 

    (3)染毒操作

    采用试验准备阶段的各种适宜条件,对染毒浓度、可吸入颗粒直径等进行控制。至少设置3个不同浓度的染毒组,每个浓度组至少10只动物,雌雄各5只。

 

    如果受试物的毒性很低,也可以采用20只大鼠(雌雄各半),进行单一剂量的急性吸入毒性试验,单一急性吸入染毒浓度应为体积分数2×10-2(气体受试物)、20 mg/L(液体受试物蒸汽)、5 mg/L(固体或液体受试物气溶胶)。

 

3.4  观察指标

    每天观察1次,连续14 d,不超过21 d,观察内容至少包括:中枢神经系统和神经肌肉系统、植物神经系统、呼吸系统、泌尿生殖系统、皮肤和被毛、消化系统和眼,以及包括体重的称量(染毒前、染毒后和处死前)与毒理学检查。

 

眼刺激性、腐蚀性试验

4.1  定义

    眼睛刺激性(Eye irritation):眼睛表面接触受试物后发生的可逆性炎性变化,在21 d内完全恢复。

 

    眼睛腐蚀性(Eye corrosion):眼睛表面接触受试物后发生的不可逆性组织损伤,在21 d内不能完全恢复。

 

4.2  试验目的

    (1)评估受试物毒性,对哺乳动物的眼睛刺激或腐蚀程度的分级提供依据;

 

    (2)确定受试物对哺乳动物是否有刺激作用或腐蚀作用;

 

    (3)为其他毒理学试验剂量的选择提供依据;

 

    (4)便于标签的管理。

 

4.3  试验方法

    受试物以一次剂量滴入每只实验动物的一侧眼睛结膜囊内,以未作处理的另一侧眼睛作为自身对照。

 

    在规定的时间间隔内,观察动物眼睛的刺激和腐蚀作用程度并评分,以此评价受试物对眼睛的刺激作用,观察期限应能足以评价刺激效应的可逆性和不可逆性。

 

    (1)受试物

    液体受试物一般不需要稀释,直接使用原液,染毒量为0.1 mL。固态受试物一般将其研磨成细粉状,过200目筛,染毒剂量为0.1 mL。气溶胶产品需撑开兔眼,在眼正前方10 cm处,对准兔眼按压气溶胶喷雾1 s。

 

    (2)试验动物

    首选体重为2.0~3.0 kg的健康成年白色家兔。

 

    (3)试验操作

    轻轻拉开家兔一侧眼睛的下眼睑,将受试物0.1 mL(或100 mg)滴入结囊膜中,使上、下眼睑被动闭合1 s,以防止受试物丢失。另一侧眼睛不处理作为自身对照。

 

    若71 h刺激反应不消失,应另选用3只家兔进行冲洗效果试验,即给家兔眼滴入(放入)受试物后30 s,用足量、流动较快但又不会引起动物眼睛损伤的水流冲洗至少30 s。

 

4.4  观察指标

    在滴入(放入)受试物后1、24、48、72 h以及第4 d和第7 d对动物眼睛进行检查。对角膜、虹膜、结膜以及其他损害效应记录并报告。

 

皮肤刺激性、腐蚀性试验

5.1  定义

    皮肤刺激性(Dermal irritation):皮肤涂覆受试物后局部发生的可逆性炎性变化。

 

    皮肤腐蚀性(Dermal corrosion):皮肤涂覆受试物后局部发生的不可逆性组织损伤。

 

5.2  试验目的

    (1)评估受试物毒性,对哺乳动物的皮肤局部刺激或腐蚀程度的分级提供依据;

 

    (2)确定受试物对哺乳动物皮肤局部是否有刺激作用或腐蚀作用;

 

    (3)为其他毒理学试验剂量的选择提供依据;

 

    (4)便于标签的管理。

 

5.3  试验方法

    将受试物一次涂覆于受试动物的皮肤上,采用自身对照,在规定的时间间隔内,观察动物皮肤局部刺激作用的程度并进行评分,以此评价受试物对皮肤的刺激作用,观察期限应足以评价该作用的可逆性或不可逆性。

 

    (1)受试物

    液体受试物一般不需要稀释,直接使用原液。固态受试物一般将其研磨成细粉状,并用水或其他无刺激性溶剂充分润湿。

 

    (2)试验动物

    首选体重为2.0~3.0 kg的健康、成年、皮肤无异常和无损伤的白色家兔。

 

    (3)试验操作

    试验前约24 h,将实验动物背部脊柱两侧被毛去除,不可损伤表皮,去毛范围至少各为6 cm2。取受试物0.5 mL(g)涂在一侧去毛皮肤上,用两层纱布和一层玻璃纸或类似物覆盖,再用无刺激性胶布和绷带加以固定。

 

    另一侧皮肤作为对照,除不加受试物外,其他处理和试验动物相同。采用封闭试验,敷用时间约为4 h。然后用清水或无刺激性溶剂清洗受试区皮肤。

 

5.4  观察指标

    于清除受试物后的1、24、48和72 h观察涂抹部位皮肤反应,一般不超过14 d。

 

皮肤变态反应(致敏)试验

6.1  定义

    皮肤刺激(Skin sensitization):测试动物在反复接触受试物后,皮肤对一种物质产生的免疫原性皮肤反应。

 

6.2  试验目的

    (1)评估受试物毒性,对哺乳动物的皮肤变态程度的分级提供依据;

 

    (2)确定受试物对哺乳动物是否可引起皮肤变态反应;

 

    (3)为其他毒理学试验剂量的选择提供依据;

 

    (4)便于标签的管理。

 

6.3  试验方法

6.3.1  试验动物

    选用健康、成年雌性或雄性豚鼠。

 

6.3.2  局部封闭涂皮试验(Buehler test,BT)

    (1)诱导接触:试验前约24 h,将豚鼠背部左侧去毛,去毛范围为4~6 cm2。将受试物约0.2 mL(g)涂在实验动物去毛区皮肤上,以两层纱布和一层玻璃纸覆盖,再以无刺激胶布封闭固定6 h。第7天和第14天以同样方法重复一次。

 

    (2)激发接触:末次诱导后14 d,将约0.2 mL(g)的受试物涂于豚鼠背部右侧2 cm×2 cm去毛区(接触前24 h去毛),然后用两层纱布和一层玻璃纸覆盖,再以无刺激胶布固定6 h。试验组动物至少20只,对照组至少10只。

 

6.3.3  豚鼠最大值试验

    豚鼠最大值试验(Guinea pig maximization test,GPMT)是试验动物通过多次皮肤涂抹(诱导接触)或皮内注射受试物10~14 d(诱导阶段)后,给予激发剂量的受试物,观察试验动物,并与对照动物比较对激发接触受试物的皮肤反应强度。

 

    (1)诱导接触(第0天)受试物组:将颈背部去毛区(2 cm×4 cm)中线两侧划定三个对称点,每点皮内注射0.1 mL下述溶液:① 用1∶1 FCA/水或生理盐水的混合物;② 耐受浓度的受试物;③ 用1∶1 FCA/水或生理盐水配制的受试物,浓度与上述②相同。

 

    对照组:注射部位同受试物组,每点皮内注射0.1 mL下述溶液:① 1∶1 FCA/水或生理盐水的混合物;② 未稀释的溶液;③ 用1∶1 FCA/水或生理盐水配制的浓度为500 g/L的溶液。

 

    诱导接触(第7天)将涂有0.5 g(mL)受试物的2 cm×4 cm滤纸敷贴在上述再次去毛的注射部位,然后用两层纱布、一层玻璃纸覆盖,无刺激胶布封闭固定48 h。

 

    对照组和试验组动物于第2次诱导接触前24 h在注射部位涂抹10%十二烷基硫酸钠0.5 mL。对照组仅用溶剂作诱导处理。将豚鼠躯干部去毛,用涂有0.5 g(mL)受试物的2 cm×2 cm滤纸敷贴在去毛区。

 

    (2)激发接触(第21天)将豚鼠躯干部去毛,用涂有0.5 g(mL)受试物的2 cm×2 cm滤纸敷贴在去毛区,然后再用两层纱布、一层玻璃纸覆盖,无刺激胶布封闭固定24 h。对照组作同样处理。试验组至少10只。对照组至少5只。

 

6.4  观察指标

    激发接触后24 h和48 h观察右侧皮肤反应,并进行评价(表1,表2)。

 

表1  变态反应试验(局部封闭涂皮法)皮肤反应评分

皮肤反应

评分

红斑和焦痂形成

/

无红斑

0

轻微红斑

1

明显红斑

2

中度至重度红斑

3

严重红斑至轻微焦痂形成

4

水肿形成

/

无水肿

0

轻微水肿(勉强可见)

1

中度水肿(皮肤隆起轮廓清楚)

2

重度水肿(皮肤隆起约1 mm或超过1 mm)

3

最高积分

7

 

表2  变态反应试验(豚鼠最大值法)皮肤反应评分

皮肤反应

评分

皮肤反应

评分

未见皮肤反应

0

中度红斑或融合红斑

2

散在或小块红斑

1

重度红斑和水肿

3

 

    当然,农药登记申请资料中登记试验资料除了毒理学中本文介绍的6项急性毒性外,还包括产品化学、药效、残留和环境影响等试验以及评估报告。     (来源:农博在线)

 

农药快讯, 2019 (22): 43-46.


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