农药快讯:2020年第4期
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水稻细菌病害的新克星——杀菌剂tolprocarb
作者:上海市农药研究所 叶 萱 编译 更新时间:2020-03-18 点击量:805

  作物真菌或细菌病害是导致作物产量降低的重要因素。而杀菌剂被用来防治这些病害,保持作物的产量和品质。水稻是亚洲各国种植的最重要作物之一。水稻的生产仍然受到许多病原微生物的威胁,需要新颖的杀菌剂来稳定地防治这些病害。

 

  Tolprocarb(图1)是日本三井化学农业公司开发的防治水稻稻瘟病(Magnaporthe grisea)的杀菌剂。

 

 

注:A、B、C为结构-活性关系研究中可修饰的取代基

图1  tolprocarb的化学结构式

 

  稻瘟病对水稻生产有极大危害,此病害的病原菌已产生抗性,故对其防治是一大挑战。虽然有许多作用机制的杀菌剂能用于防治此病害,但一些杀菌剂防效已不佳。稻瘟病抗性菌株,例如抗呼吸链复合体Ⅲ——醌外位点细胞色素bc1(醌外部抑制剂:Qol)抑制剂或黑色素生物合成中脱水酶抑制剂(黑色素生物合成抑制剂——脱水酶抑制剂;MBI-Ds)菌株产生。对tolprocarb的两种作用机制进行了研究:抑制黑色素生物合成途径中聚酮合酶(MBI-P)和诱导植物系统性抗性。由于tolprocarb具有独特的作用机制,推测靶标真菌发展抗性的风险会低。Tolprocarb不仅对稻瘟病,而且对细菌病害有强的生物活性,对哺乳动物或环境的影响小。

 

先导物的合成

1.1  先导物的发现

  在对卵菌纲病害杀菌剂开发的过程中,发现先导物化合物1对水稻稻瘟病有防治作用。化合物1和缬霉威(iprovalicarb)仅在甲基的有无和羰基的位置不同。卵菌纲病原菌杀菌剂缬霉威对稻瘟病没有活性。有趣的是化合物1对卵菌纲植物病原菌如使马铃薯和番茄发生枯萎病的晚疫病菌(Phytophthora infestans)没有活性。缬霉威结构的小小改变,其杀菌活性谱发生很大变化,化合物1的作用机制不同于缬霉威(图2)。

 

  在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上,稻瘟病菌菌丝由于形成黑色素而变黑,而用化合物1处理后,菌丝的延长没有被抑制,而颜色变白。化合物1处理的菌丝的颜色不同于用传统MBI处理的,这表明用化合物1和MBI处理后,积累的中间物不同。此外,研究表明化合物1和MBI-D没有交互抗性。这些结果表明化合物1作用于黑色素生物合成途径中新的靶标位点。因此以化合物1为先导物,对其进行结构修饰。

 

 

图2  缬霉威和化合物1的化学结构式的对比

 

1.2  先导化合物的优化和构效关系

  先导化合物1的结构被分成3个部分:A-C(图1),对每部分结构进行优化,对其构效关系进行了总结(表1)。

 

化合物1对稻瘟病构效关系的情况

构效关系

A

OCH2CF3≥SCH2CF3>NHCH2CF3, CH2CF3OCH2CF3>O-i-Pr>OCH3

B

i-Pr, CF3(racemic)>n-Pr>H>i-Bu>CH2SCH3

C

4-CH3>4-Cl>H>2-CH33, 3-CH3

 

  基团A中的氨基甲酸酯或硫代氨基甲酸酯键比酰胺或脲键有更高的活性。在A基团端的异丙基被2,2,2-三氟乙基取代后化合物活性增加。甲基氨基甲酸酯衍生物比异丙基氨基甲酸酯衍生物的活性低。基团B中的S-对映异构体比R-对映异构体的活性高。三氟甲基衍生物和异丙基衍生物的活性水平相同。正丙基衍生物的活性低于异丙基衍生物。疏水异丁基和亲水的甲基磺酰甲基(methylsulfanyl methyl group)的引入会降低化合物的活性。

 

  基团C中,引入对甲基比引入邻甲基或间甲基活性高。在对位引入氯原子比引入甲基的活性低。未取代化合物比2、3位引入甲基活性高,但比4-甲基和4-氯类似物的活性低。C环第4位的取代好像能提高活性。

 

  最后,在考虑各种因素后,例如在田间试验的长残留活性,选择tolprocar来开发。

 

合成

  以N-叔丁氧基羰基-(N-Boc-)保护的L-缬氨酸甲酯(a)合成tolprocarb(图3)。首先与硼氢化钠发生还原反应,之后发生Mitsunobu偶联反应,再肼解生成胺衍生物(d)。之后形成酰胺键,再去N-Boc保护后得到胺衍生物(f)。最后胺衍生物(f)和氯甲酸酯(g)发生反应生成tolprocarb。

 

图3  tolprocarb的合成途径

 

抑制菌丝的生物合成

3.1  作用机制

  在1965年,三共株式会社(现在称为三井化学农业公司)开发了MBI和2,3,4,5,6-五氯苯甲醇。在20世纪70年代研究了黑色素生物合成的还原酶抑制剂(黑色素生物合成还原酶抑制剂;MBI-Rs),在20世纪90年代研究了MBI-Ds。已知浅蓝菌素为黑色素生物合成过程中的聚酮合酶(PKS)抑制剂,但在tolprocarb进入市场、实际应用之前,没有能抑制PKS的其他化合物,tolprocarb是第一个实践意义上抑制PKS的杀菌剂。

 

  在tolprocarb开发的早期,就发现在含有tolprocarb的琼脂培养基上培养稻瘟病菌菌落时,稻瘟病菌的着色受到了抑制。与用含有传统的MBI,例如MBI-R或MBI-D的琼脂培养基培养的菌落相比,含有tolprocarb的培养基培养的菌落着色少。进行了恢复试验来评估了tolprocarb的作用机制。用含有黑色素中间体和tolprocarb的琼脂培养稻瘟病菌来测定丝状菌落的颜色。在含有tolprocarb琼脂培养基上的颜色浅的菌落再在含有1,3,6,8-四羟基萘(1,3,6,8-THN)的培养上培养,菌落的颜色恢复正常。因此,推测tolprocarb通过抑制调节聚酮合酶和酮内酯(pentaketide)环化的1,3,6,8-THN上游的聚酮合酶活性而抑制菌落的着色(图4)。这通过测定含有稻瘟病菌的PKS基因的转基因米曲霉(Aspergillus oryzae)中1,3,6,8-THN积累的量来测定。与一些传统的MBI相比,只有tolprocarb抑制离体PKS的活性。这些结果表明tolprocarb作用于稻瘟病菌PKS,这不同于其他传统的MBI。由于此作用机制,杀菌剂抗性行动委员会(FRAC)把tolprocarb分为MBI-PKS(MBI-P)类别。

 

图4  稻瘟病菌中DHN黑色素的生物合成途径和MBI抑制途径中的酶活性

 

3.2  对稻瘟病菌生命周期的影响

  MBI-D和MBI-R等传统MBI对稻瘟病菌生命周期的影响已被确定。这些杀菌剂抑制稻瘟病菌附着胞的黑化作用,阻碍分生孢子从分生孢子梗分散。研究发现了tolprocar对这些细胞和孢子的作用。最可能的是,MBI-D/MBI-R和tolprocarb抑制稻瘟病菌附着胞的黑化,阻碍分生孢子的分散。暴露于tolprocarb的脱色分生孢子比有色分生孢子对阳光(紫外线光)更敏感。用tolprocar处理后的脱色分生孢子的发芽率要低于用MBI-D或MBI-R杀菌剂处理的,甚至在多云或雨天(紫外线强度:500~2 000 µW/cm2)。用投射电子显微镜法(TEM)发现附着胞或分生孢子的黑化作用被抑制。稻瘟病菌附着胞的黑化对侵染钉产生膨压,渗透进入寄主细胞。相比之下,对分生孢子中黑色素功能研究不多。如前所述,MBI抑制分生孢子从分生孢子梗分散,但具体机制未知。然而,黑化作用与分生孢子从分生孢子梗分散的能力有关。

 

系统性获得抗性(SAR

4.1  拟南芥系统性获得抗性

  SAR是植物体的非特异性系统性免疫响应,由信号化合物水杨酸(SA)诱导产生。NPR1和WRKY45调节SA信号传导途径中的不同病程相关基因,例如PR-1、PR-2、PR-5和PBZ1,这些基因编码葡聚糖酶和几丁质酶等PR蛋白,还调节植物抗毒素合成途径。

 

  测定含有烟草PR-1a启动子-Fluc(荧光素酶)报告基因框架(PR-1a:Fluc)的转基因拟南芥的研究表明,tolprocarb能诱导拟南芥产生系统获得性抗性。在拟南芥的2个生长阶段:刚发芽和3周龄大的植株中发现了PR-1a启动子的活性。在处理拟南芥苗后96 h,检测到拟南芥苗中PR-1a启动子活性;灌溉处理成熟植株后96、120 h检测到植物体内PR-1a启动子的活性。用tolprocarb处理成熟拟南芥叶片,10 d后接种十字花科黑斑病菌(Pseudomonas syringae pv. maculicola,Psm),评估tolprocarb对此病菌的防治潜力。接种3 d后,Psm侵染量降低。结果表明tolprocarb处理能诱导SAR活性。

 

4.2  水稻SAR活性

  已确定tolprocarb是拟南芥SAR活性的强诱导剂,因此评估了tolprocarb是否能诱导水稻产生SAR活性。用定量逆转录聚合酶链反应发现用tolprocarb处理后水稻中PR基因的活性。在处理后24 h或72 h,tolprocarb促进SA-介导的信号传导途径相关基因的表达,例如PBZ、β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶1。相反,不会促进茉莉酮酸-(JA-)介导的信号传导途径有关的基因表达。这些表明tolprocarb通过加速SA信号传导途径而诱导SAR活性。

 

  已知SA和JA为诱导植物产生免疫力的信号传导化合物。特别是,SA信号传导途径与保护植物免受病原真菌或细菌危害的功能有关。因此,预期tolprocarb具有防治水稻细菌病害的潜力,发现具有防治水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)的活性。

 

  Tolprocarb能阻止水稻叶上病害症状的扩展。tolprocarb主要通过MBI-P活性而对稻瘟病有效,但不清楚是否第2种作用机制——SAR活性也在其中起作用,且一直难以发现是MBI-P还是SAR所致活性。Hiroyuki Hagiwara等应用黑色素中间体的2个恢复试验来区分它们。首先,在用黑色素中间体1,8-二羟基萘处理的水稻叶上接种稻瘟病菌,培养。再在表面交联(SCL)的琼脂培养基上接种稻瘟病菌,进行培养,通过人工培养基上的附着胞来观察稻瘟病菌的侵染。在第1个试验中,tolprocarb处理阻止了水稻细胞上的黑色素恢复的稻瘟病菌的附着胞渗透入水稻。而后者tolprocarb处理后没有抑制SCL培养基上的病原菌的渗透。这两个结果表明活体植物细胞是tolprocarb处理后阻止黑色素恢复的稻瘟病菌侵染的必要条件。因此,这表明tolprocarb通过2种作用机制抑制稻瘟病菌的侵染:MBI活性和诱导寄主的防御响应。

 

对稻瘟病的活性

5.1  在田间对稻穗颈瘟的活性

  含有9%或4% tolprocarb的颗粒剂是内吸性杀菌剂,用于育苗箱中植物的根部,含有3% tolprocarb的颗粒剂施于水稻田水中。Tolprocarb对叶瘟和穗颈瘟有强的防治活性,尤其对穗颈瘟的防效特别高。用约束极大似然法进行的meta分析和2007-2015年用9%或4% tolprocarb颗粒剂处理的育苗箱的田间试验防效数据证实了此特性。3%颗粒剂用于水稻田水处理的数据统计分析表明在水稻抽穗前5~29 d处理对穗颈瘟有优异的防效。

 

  Tolprocarb在各种类型土壤中都稳定;在36种类型土壤中吸附较小,包括日本的25种火山土,土中的有机碳含量、阳离子的交换能力、磷酸的吸收能力和pH等这些因素都对吸附没有影响。试验土壤的吸附率为7%~42%,而20%~100%吸附的tolprocarb能被水解吸。

 

5.2  对抗性菌株的活性

  水稻病害抗性菌株的出现影响了水稻的生产,是水稻种植中一大问题。在日本,抗MBI-D或QOl菌株的出现成为水稻生产中的难题。Tolprocarb对抗MBI-D或Qol菌株有稳定的防治作用,将会是实际应用中防治水稻真菌病原菌很好的选择。

 

总结

  Tolprocarb是从iprovalicarb类似物的衍生发现的,但其作用机制完全不同于MBI-P。Tolprocarb也能诱导拟南芥和水稻产生SAR,通过诱导SAR活性而对细菌病害和稻瘟病有很强的活性。由于这两个作用机制和防效高,抗性不易产生。在水稻田,tolprocarb颗粒剂对稻瘟病有高的防效,对穗颈瘟有卓越的防效,包括对MBI-D或Qol杀菌剂有抗性的菌株。根据这些特点,tolprocarb不仅对稻瘟病而且对水稻细菌病害有稳定、较强的防效。Tolprocarb用于作物生产将会有很好应用前景。       (来源:《世界农药》2019年第5期)

 

农药快讯, 2020 (4): 31-33.


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