农药快讯:2020年第22期
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黄萎病致病机理新发现:病菌可通过操控宿主植物微生物群组从而提高侵染效率!
更新时间:2020-12-02 点击量:2060

病原体在感染其宿主时能够分泌效应蛋白用以协助其感染宿主。越来越多的证据表明宿主的微生物群组在保护宿主不被感染的过程中发挥重要作用。近日瓦格宁根大学与研究中心的植物病理学实验室Bart P. H. J. Thomma团队在Nature Plants期刊上,发表了题目为microbiome manipulation by a soil-borne fungal plant pathogen using effector proteins的研究论文,提出病原体可通过进化反向操控宿主的微生物群组,从而使它更有利于入侵宿主。他们发现VdAve1(一种黄萎病所分泌的毒性蛋白)能够抑制与之相互拮抗的细菌并操控番茄和棉花的微生物组,从而提升黄萎病的感染能力。他们证明了植物病原体能使用效应蛋白去调节宿主体内和体外的微生物组的组成,并且为新型抗生素的开发提供了新的方向。

 

病原体为了能够成功入侵宿主,可以分泌大量效应蛋白并通过各种复杂的机制去感染宿主。目前多数研究集中研究病原体与宿主之间的互作,而忽视其周围环境的影响。高等生物(包括植物)与大量微生物共同形成的微生物组是决定其健康状况的关键因素。植物的大多数感染都发生在根部,植物通过分泌特殊物质从而确定根际微生物组的组成,并且能够吸引有益的微生物用以抑制病原体入侵。因此,他们认为植物病原体进化出机制来抵消这种作用并且调节宿主微生物组成从而成功感染宿主,这个过程可能是通过分泌特殊的效应蛋白而完成。

 

大丽轮枝菌是一种通过土壤传播的真菌,可感染数百种植物,导致植物维管束枯萎,能够让其菌核持久静止在土壤中存活,又因附近的植物根部所释放丰富的营养物质被唤醒,通过土壤向根部移动,并通过根部感染植物,最终导致整个植株坏死。

 

他们先前鉴定出大丽轮枝菌所分泌一种富含半胱氨酸的效应蛋白Ave1,该蛋白被番茄的免疫系统认定为无毒性蛋白,因为它携带了相应的免疫受体Ve1。然而在缺少Ve1的宿主植物中VdAve1被当作毒力效应子,可促进真菌定植和疾病感染。

 

大丽轮枝菌的效应基因Ave1不仅在宿主感染中高量表达,同时在体外生长和模拟土壤定植条件下也高量表达,表明这并非一个定向靶基因。

 

为了评估VdAve1的潜在抗菌活性,他们创建了一种体外系统,将与植物相关的细菌在番茄木质部液中孵育,用于模仿VdAve1在自然环境下的感染过程,并且分析VdAvde1的存在与否,是否会对于这些细菌生长的影响。革兰氏阳性菌(Arthrobacter sp.、Bacillus subtilisStaphylococcus xylosusStreptomyces sp)其生长被显著抑制,革兰氏阴性菌对蛋白的敏感性有差异。用VdAve1处理一组真菌物种和植物原生质体后,未发现其对于真菌和原生质体有影响,表明其仅对细菌有作用。为了进一步表征VdAve1的抗菌活性,他们通过电子显微镜观察蛋白处理对于细菌的影响,从而确定效应蛋白是否具有抑菌或者杀菌的效果,分析了发现VdAe1高敏感的革兰氏阳性菌B.subtilis对蛋白的反应。在VdAe1的用量为8 µM浓度条件下已经导致了细菌细胞起泡和肿胀,随后裂解并死亡,表明VdAve1可能是通过杀菌作用从而达到抗菌效果。

 

为了测试是否VdAve1的同源物具有相同的杀菌活性,他们选择了氨基酸相似性高达90%的VnAve1作为对照。同样其同源物也表示出一定程度上的杀菌活性。这表明了13个差异的氨基酸导致了其毒性的差异。

 

基于VdAve1在体外强选择性的杀菌活性,他们认为大丽轮枝菌可利用其效应蛋白抑制其他微生物来影响宿主微生物组的组成。他们分析了番茄和棉花微生物群落的16S核糖体DNA谱。在接种后10 DPA时确定根微生物的组成,他们没有观察到微生物多样性(α多样性)发生重大变化。但是,位于β多样性的主坐标分析显示根据微生物群的明显分离。在VdAve1存在的条件下鞘胺醇单胞菌被抑制得最为明显,表明其对于VdAve1最为敏感。在棉花中基于扩增子序列变异(ASV)聚类显示出8个差异丰富度的分类单元,包括鞘胺醇单胞菌单元。由于番茄和棉花定殖期间大丽轮枝菌分泌VdAve1会导致其根微生物群中鞘氨醇单胞菌减少,因此他们猜测VdAve1对该细菌菌群内的大部分细菌具有广泛的功效。为了验证这一猜想,他们鉴定了与野生大丽轮枝菌相比具有VdAve1缺失突变体的微生物群论中的ASV平均丰度的增加。结果表明SphingomonasNovosphingobiumSphingopyxisSphingobium和鞘氨醇单胞菌一样对于VdAve1比较敏感。

 

为了测试VdAve1是否确实能够直接操纵微生物群落,并确认根部微生物组组成的变化不是由于宿主操纵的间接影响,他们用纯净的VdAve1处理了一个植物相关细菌的群落,并分析了微生物16S核糖体DNA谱的变化。果然,VdAve1明显影响了微生物群落的组成。细菌顺序的成对差异丰度分析再次显示,在存在VdAve1的情况下,鞘氨醇单胞菌显著被抑制。总而言之,这些发现证实了VdAve1直接操纵微生物组组成的能力,并进一步证实了先前观察到的对VdAve1活性的直接影响对植物鞘氨醇单胞菌的影响。

 

通过在土壤中或在补充了土壤的Murashige和Skoog(MS)培养基中进行的大丽轮枝菌定植试验表明,在存在土壤微生物群落的情况下,VdAve1有助于大丽轮枝菌的适应性(即生物量积累)。在没有土壤微生物的情况下,未检测此类变化,表明VdAve1促进侵染宿主是基于其抗菌活性。因此,根据基于MS培养基中微生物群的Bray-Curtis异质性的主坐标分析推断,VdAve1的分泌确实影响了群落结构,在土壤中检测到的效果较差,可以说是由于稀释作用更强。

 

为了进一步确定鞘氨醇单胞菌属对于VdAve1的敏感性,按照之前的方法对几种鞘氨醇单胞菌(NovosphingobiumSphingopyxis和两种其他的Sphingomonas)进行处理,表明VdAve1对于许多鞘氨醇单胞菌属有作用。由于VdAve1的选择性功效以及对番茄和棉花微生物群中鞘氨醇单胞菌的强效作用,他们认为在没有VdAve1的情况下,这些细菌可能抑制大丽轮枝菌的生长。将大丽轮枝菌与Novosphingobium sp(鞘氨醇单胞菌的一种)一同培育发现,与分泌VdAve1的大丽轮枝菌相比,VdAve1的缺失突变体生物量减少,这也表明了鞘氨醇单胞菌能抑制大丽轮枝菌,并且解释了VdAve1的重要性。利用细菌存在与否来对野生型大丽轮枝菌进行生物定量分析发现用S.macrogoltabida会对黄萎病产生不利影响。用16S rDNA分析和实时定量PCR检测野生型大丽轮枝菌和VdAve1的突变体存在条件下S.macrogoltabida含量的差异,发现VdAve1分析显著影响S.macrogoltabida的增殖,以抵消其保护作用。因此,这些数据支持了以下假设:在宿主定植过程中,大丽轮枝菌分泌VdAve1效应子与包括Sphingomonadales在内的细菌产生拮抗相互作用,以促进其感染宿主。

 

为了测试VdAMP2的潜在抗菌活性,他们尝试异源效应蛋白代替VdAve1。他们得出结论,VdAMP2通过其在微生物竞争中的功效而有助于大丽轮枝菌感染植物。

 

如今,人们普遍认识到宿主的微生物组在宿主对健康起着至关重要的作用,因此,宿主可以塑造其有利于自身的微生物组,以预防或抑制疾病。目前已经确定,病原体在试图进入宿主的过程中会分泌出各种性质的效应分子,他们的研究中证明在土壤中广泛分布的枯萎病原菌大丽轮枝菌能够使用效应蛋白,通过选择性操纵局部微生物群来促进其定殖。因此,除了植物病原体效应蛋白能直接与宿主发生作用外(包括针对宿主分泌的防御分子的免疫应答和自我防御),他们还揭示了一种病原入侵的新机制,植物病原体通过分泌效应子控制微生物组从而感染植物。      (来源:植物生物技术Pbj)

 

农药快讯, 2020 (22): 8-9.

tag: 黄萎病、致病机理、宿主植物微生物群、大丽轮枝菌  

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