农药快讯:2021年第2期
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浙江省草莓灰霉病菌对腐霉利、氟苯醚酰胺的抗性、检测及其治理
更新时间:2021-02-04 点击量:2968

  草莓灰霉病是由灰葡萄孢(Botrytis cinerea)引起的,是草莓生产中危害最大的病害之一。化学防治是防治草莓灰霉病的主要手段,二甲酰亚胺类杀菌剂腐霉利是目前灰霉病防治上大量应用的杀菌剂。同时,灰葡萄孢是杀菌剂抗药性行动委员会(FRAC)列出的抗药性风险最高的病原菌之一。因此,明确其对生产上常用药剂的抗药性现状以及在新药剂投入使用前开展抗药性风险评估对灰霉病的防治和抗药性管理具有重大意义。

 

  浙江农林大学农业与食品科学学院张传清团队通过区分剂量法测定了草莓灰霉病菌对腐霉利的抗性,根据抗药性分子机制建立了灰葡萄孢侵染早期草莓无症状时的腐霉利抗性快速检测体系,并评估了其对新型创制杀菌剂氟苯醚酰胺的抗药性风险,为氟苯醚酰胺后续用于灰霉病防治提供依据。

 

浙江省草莓灰霉病菌对腐霉利的抗性

  为明确浙江省草莓灰霉病菌对腐霉利抗药性现状,该团队在2017—2018年从浙江省5个地区采集、分离共获得200株草莓灰霉病菌,通过区分剂量法测定其对腐霉利的抗药性水平,并分析了敏感菌株和抗性菌株的生物学特性和抗药性分子机制。

 

1.1  草莓灰霉病菌对腐霉利的抗性频率

  从浙江省5个地区采集分离的200株灰葡萄孢对腐霉利的总抗药性频率高达71.5%,其中腐霉利低水平抗药性菌株(LR)100株,频率为50%;中水平抗药性菌株(MR)38株,频率为19%;高水平抗药性菌株(HR)5株,频率为2.5%。

 

图 1 浙江省草莓灰霉病菌对腐霉利的抗药性

 

  试验结果表明浙江省草莓灰霉病菌对腐霉利的总抗性频率高达71.5%,但多以低抗菌株为主。与江苏、辽宁省等地相比,抗性水平相对较低,这可能与不同地区施药水平不同有关。

 

1.2  腐霉利抗性菌株的生物学特性

(1)菌丝生长速率与菌丝干重

  从表1可知,抗药性菌株的生长速率均显著低于敏感菌株。敏感菌株与抗药性菌株的菌丝干重有一定的差异,但这与菌株是否对腐霉利具有抗性没有联系。如抗药性菌株JSB-16的菌丝干重为0.46 g,敏感菌株JSB-3的干重为0.27 g,而同为抗药性菌株的BLB-2的干重则为0.11 g。

 

表 1 腐霉利敏感与抗药性菌株的生长速率与菌丝干重比较

菌株

抗性水平

菌落直径/mm

生长速率/(mm·d-1)

菌丝干重/g

24 h

48 h

72 h

B05.10

S

14.5±0.55AB

29.33±1.37BC

59.33±0.82B

18.11±0.27A

0.23±0.10BC

JSB-3

S

15.5±0.55A

33.33±0.82A

60.83±0.75A

18.61±0.25A

0.27±0.02B

TXB-4

HR

12.33±0.52BC

27.67±1.21C

47.50±2.95C

14.17±0.98C

0.16±0.01C

BLB-13

HR

12.12±0.41D

24.83±0.41D

49.00±0.63C

14.67±0.21C

0.16±0.02C

PSB-12

HR

8.00±0.00E

23.67±0.82D

49.67±1.75C

14.89±0.58C

0.13±0.01CD

BLB-2

MR

12.00±0.90CD

28.33±1.21BC

56.83±0.75B

16.95±0.25B

0.11±0.01D

JSB-28

LR

11.83±3.12CD

30.00±0.00B

57.00±0.63B

16.94±1.21B

0.08±0.01D

XJB-25

LR

8.67±0.52E

25.33±0.52D

50.50±0.84C

15.17±0.28C

0.12±0.02D

XJB-27

LR

10.12±0.41CDE

27.50±1.38C

50.00±2.68C

15.00±0.89C

0.15±0.08CD

JSB-16

LR

9.83±1.60DE

24.33±1.51D

55.00±0.63B

16.67±0.21B

0.46±0.04A

注:采用Duncan差异性分析,数字后字母表示不同菌株间差异显著性(P=0.01)

 

(2)产孢量的比较

  腐霉利不同敏感性菌株的产孢量如图2所示。从图中可以看出,敏感菌株B05.10产孢量最高,抗药性菌株JSB-28的产孢量最低。抗药性菌株的产孢量均显著低于敏感菌株,说明抗药性菌株的产孢能力下降了。

 

图 2 腐霉利抗、敏菌株的产孢量比较

 

(3)致病力的比较

  腐霉利不同敏感性菌株的致病力如图3,结果表明不同菌株之间的致病性有显著差异。在接种3 d后,敏感菌株B05.10致病性最强,其病斑直径为22.5 mm,而抗药性菌株BLB-2的致病性最弱,其病斑直径为12.5 mm。相比敏感菌株的致病力,所有抗药性菌株的致病力都显著下降。

 

图 3 腐霉利抗、敏菌株的致病力比较

 

  通过对不同敏感性菌株的适合度比较发现,抗性菌株在生长速率、产孢量和致病性等方面均显著低于敏感菌株,表明敏感菌株在田间有更好的生存能力。既然抗性菌株的适合度弱,那么在腐霉利停用一段时间后,抗性菌株群体可能会下降,通过合理的抗药性治理策略,腐霉利就有可能继续使用。

 

草莓灰霉病菌对氟苯醚酰胺的抗性风险评估

  氟苯醚酰胺是由华中师范大学创制的一种新型琥珀酸脱氢酶抑制剂类(SDHI)杀菌剂,开发代号为:Y13149。该团队评估了氟苯醚酰胺在防治草莓灰霉病上的抗药性风险,确认其是否可以用于灰霉病的防治及腐霉利的抗药性治理。

 

2.1  抗药性突变体的适合度

(1)抗药性突变体的生长速率测定

  3个抗药性突变体与亲本菌株菌丝的生长速率如图4所示。突变体的生长速率与亲本菌株相比都有所降低。差异显著分析表明:在调查的72 h内,亲本菌株与突变体菌株ZYB-2之间的菌丝生长速率差异不显著,而与突变体菌株ZYB-1和ZYB-3之间菌丝生长速率差异显著。

 

图 4 抗药性突变体与亲本菌株的菌丝生长速率比较

 

(2)抗药性突变体的产孢量测定

  抗药性突变体的产孢量如图5所示,所有抗药性突变体的产孢量较亲本菌株都有所下降,除突变体ZYB-2外,突变体菌株与亲本菌株的产孢量差异显著。

 

 

图 5 抗药性突变体与亲本菌株产孢量比较

 

(3)抗药突变体的致病力测定

  采用离体叶片法测量了3个抗药性突变体与亲本菌株对草莓叶片的致病力(图6)。结果表明:在接种72 h后,3个突变体菌株和亲本菌株侵染叶片的病斑直径分别为13、16、15和21 mm。抗药性突变体的致病力显著弱于亲本菌株。

 

图 6 抗药性突变体与亲本菌株致病力比较

 

  抗药性突变体的生物学性状是室内抗药性风险评估的重要内容之一,包括生长速率、产孢量和致病性等参数指标。本研究表明,抗药性突变体的产孢能力、侵染能力以及生长速度均低于敏感菌株,存在适合度补充效应。

 

2.2  突变体的遗传稳定性测定

  3个抗药性突变体和亲本菌株在无药PDA培养基上连续培养9代后,亲本菌株和突变体ZYB-1、ZYB-2的EC50值变化较小(表2),说明抗药性突变体菌株ZYB-1、ZYB-2的抗性能够稳定遗传。而抗药性突变体菌株ZYB-3的EC50值则下降了接近一倍,结果显示出中水平抗性的菌株在遗传稳定性上弱于低水平抗性的菌株。

 

  有研究报道对腐霉利表现低抗的灰霉菌株经过3代连续培养后其敏感值会降低最后变为敏感菌株。抗氟苯醚酰胺突变体经过9代的连续培养后,中抗菌株的敏感值下降了近一倍,但低抗菌株的敏感值并未下降,这表明菌株产生抗性后在田间会保持低抗水平。

 

表 2 抗药性突变体的抗性遗传稳定性

菌株

敏感值(EC50)/(μg·mL-1)/抗性倍数

第1代

第3代

第5代

第7代

第9代

B05.10

1.018

1.033

1.214

1.060

0.955

ZYB-1

28.656/28

29.738/29

27.383/23

30.188/28

27.241/29

ZYB-2

23.651/23

25.925/25

27.960/23

25.940/24

25.114/26

ZYB-3

61.421/60

54.875/53

54.167/45

40.867/39

36.667/38

 

2.3  交互抗性

  供试草莓灰霉病菌对氟苯醚酰胺的敏感性与对啶酰菌胺、氟啶胺、咯菌腈和腐霉利的敏感性之间的相关系数分别为:0.706 4、0.389 4、0.036 5、0.783 2(表3),相关系数较低。F检验的P值分别为:0.160、0.376、0.809、0.115,P>0.05,在P=0.05上差异不显著。说明氟苯醚酰胺与啶酰菌胺、氟啶胺、咯菌腈和腐霉利均无交互抗性。

 

表 3 灰霉病菌对氟苯醚酰胺、氟啶胺、咯菌腈、腐霉利以及啶酰菌胺的敏感性

菌株

敏感值(EC50)/(μg·mL-1

氟苯醚酰胺

啶酰菌胺

氟啶胺

咯菌腈

腐霉利

B05.10

1.028

1.981

0.007

0.011

0.684

ZYB-1

30.227

14.251

0.002

0.001

0.470

ZYB-2

25.041

7.307

0.01

0.004

0.931

ZYB-3

80.447

15.638

0.014

0.007

2.204

 

 

图 7 氟苯醚酰胺与氟啶胺、咯菌腈、腐霉利以及啶酰菌胺的交互抗性

 

  氟苯醚酰胺对腐霉利抗感的灰霉菌株都要较好的抑制效果。交互抗性结果显示,其与现用的主要灰霉病防治药剂腐霉利、氟啶胺、咯菌腈等之间均没有交互抗药性。有趣的是,敏感性相关分析及抗药性突变体研究都表明氟苯醚酰胺与同为SDHI类杀菌剂的啶酰菌胺之间也无交互抗性,出现这种现象的原因还有待进一步阐明。后者是目前灰霉病防治的骨干杀菌剂,在市场上应用已经超过10年,抗药性也已经比较严重。

 

  综上所述,本文综合评价草莓灰霉病菌对氟苯醚酰胺有着中至低等水平的抗性风险。建议氟苯醚酰胺用于防治草莓灰霉病及抗药性治理。

 

  本文节选自:郑远,浙江省草莓灰霉病菌对腐霉利的抗性、快速检测及其治理[D].浙江农林大学,2020.

 

农药快讯, 2021 (2): 30-32; 34.

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