由于Bt抗虫棉的大量种植，很多抗虫棉种植地（包括中国），原本处于次要地位的害虫盲蝽蟓急剧增加，取代棉铃虫成为主要害虫。因盲蝽蟓属于半翅目昆虫，对Bt蛋白表现是不敏感的，因此培育能对半翅目害虫（盲蝽蟓、蚜虫、飞虱、叶蝉等）有防治效果的作物将成为未来抗虫性状的开发重点。今天，我们来看一看孟山都公司开发的一款抗盲蝽蟓棉花MON88702。

1  修饰的性状
    随着对Bt蛋白结构和作用机理的深入认识，通过结构域互换和氨基酸替换等手段改造原始的Bt蛋白，赋予其新的功能，成为创造新杀虫蛋白、扩展作物抗虫谱的一条途径。孟山都公司从Bt菌EG2934中分离到一个Cry类的Bt蛋白Cry51Aa2，发现其对半翅目昆虫豆荚盲蝽（Lygus hesperus）和苜蓿盲蝽（Lygus lineolaris）有一定的杀虫活性。用其培育的转基因棉花可以抑制豆荚盲蝽的存活和发育，但对苜蓿盲蝽的控制效果不佳，无法满足商业化生产的需要。

    通过分析蛋白的晶体结构，丙氨酸突变筛选关键位点，以及进一步的诱变和测试，得到了Cry51Aa2蛋白的变异体Cry51Aa2.834_16（F46S、Y54H、S95A、F147S、Q149E、S167R、P219R、R273W、HYS_D (196–198)）。Cry51Aa2.834_16改善了蛋白和昆虫中肠受体的结合、寡聚体的组装以及穿孔的效率，其对两种盲蝽蟓的杀虫活性均提高了200倍以上。利用表达该变异体蛋白的基因培育的转基因棉花在田间种植时能够将盲蝽蟓的种群降低30多倍。

2  转化体的开发过程及特征
    研究人员将表达Cry51Aa2.834_16蛋白（mCry51Aa）的核酸序列（密码子优化）构建到载体PV-GHIR508523上。该载体包含两段T-DNA区，其中一个表达mCry51Aa蛋白，另外一个表达壮观霉素筛选标记基因aadA。mCry51Aa表达盒还包括拟南芥热激蛋白81-2启动子、花椰菜花叶病毒35SRNA终止子、玄参花叶病毒35SRNA增强子。在农杆菌菌株AB33的介导下，载体转入棉花受体DP393中，得到优异转化体MON88702。

    通过Illumina HiSeq高通量测序技术，获得了MON88702转化体和DP393受体80倍深度的测序数据，并最终确定了转化体的插入位置，且基因组已不含有筛选标记T-DNA和载体骨架。插入位置只含有一个mCry51Aa的T-DNA区，没有引起其他的插入、缺失和重排，T-DNA边界虽然有缺失，但是不影响mCry51Aa基因的表达。此外，插入位置潜在的ORF也不会带来新的负面影响。

    2015年，在美国主要棉产区的5个试验地开展了目标蛋白的表达模式分析。MON88702种子中mCry51Aa蛋白的含量为130 μg/g干重，占总蛋白0.054%。研究者从100 g种子中提取了mCry51Aa蛋白，并与Bt菌中表达的蛋白进行了实质等同性分析。植物中mCry51Aa蛋白分子量为34.2 kDa，具有免疫活性，没有糖基化修饰，测定的氨基酸序列可以覆盖理论序列的55%，N端的16个氨基酸与理论序列一致，蛋白具有杀虫活性。Bt菌中表达的mCry51Aa蛋白与植物中表达的蛋白性质相当，具有等同性。

    毒性和致敏性的生物信息学预测分析结果显示，mCry51Aa蛋白与已知的致敏原和毒蛋白的相似性极低。稳定性试验显示，在55℃以上或在模拟胃肠消化液中外源蛋白会迅速降解，表明了其热稳定性和消化稳定性很低。经口急性毒性试验结果显示，5,000 mg/kg体重的蛋白剂量下，小鼠生长发育正常，没有急毒现象。这就在一定程度上证明了新表达蛋白质的食用安全性。

    研究人员在实验室、温室和田间条件下检测了MON88702及其表达的蛋白mCry51Aa对七大目（包括半翅目、缨翅目、鞘翅目、鳞翅目、膜翅目、弹尾目、单向蚓目）共计18种无脊椎动物的生长发育的影响。结果显示，MON88702以及表达的蛋白对农田系统中重要的非靶标生物（包括传粉生物、有益天敌、腐生生物）均没有不利的影响。

    对采集于2015年种植季5个试验点的转基因和对照棉花种子材料进行主要成分分析，结果显示，56个分析项目中有9个项目虽然与对照有差异，但是变动幅度较小，且仍然在参照值的范围内。

    这些结果证明了MON88702转基因棉花的安全性。

3  上市前的准备
    2018年，抗盲蝽蟓棉花MON88702已获得了美国、加拿大、澳大利亚、新西兰政府的食用许可。

4  产权保护情况
    孟山都公司对盲蝽蟓杀虫蛋白序列及改造方式申报的相关专利为：US 9713334、US 9546378、US 8609936、US 9974302、US 9322033（含有优先权文件）。其中通过PCT途径在中国知识产权局申请的专利为“来自Bacillus thuringiensis的半翅目和鞘翅目活性的毒素蛋白”（200880020577.1授权）和“对半翅目昆虫种类有毒的蛋白质”（201380023787.7授权）。      （莱肯生物）

农药快讯, 2019 (3): 9.