农药快讯:2020年第21期
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假单胞菌代谢产物藤黄绿菌素化学结构、生物合成及应用潜力研究进展
作者:上海交通大学生命科学技术学院 崔 莹,宋 凯,何亚文 更新时间:2020-11-23 点击量:2204

  假单胞菌(Pseudomonas)广泛分布于土壤、水、动植物体等生物和环境生态位,主要包括荧光假单胞菌(P. fluorescens)、铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)、防御假单胞菌(P. protegens)、绿针假单胞菌(P.chlororaphis)、恶臭假单胞菌(P. putida)、丁香假单胞菌(P. syringae)、施氏假单胞菌(P. stutzeri)和门多萨假单胞菌(P. mendocina)等。按照功能分,假单胞菌又可分为植物促生和生物防治菌、植物病原菌、人类条件致病菌、生物修复菌。许多植物根际促生假单胞菌通过分泌一种或几种代谢产物来抑制植物根际病原菌的繁殖,达到促进植物生长的效果,这些代谢产物包括 2,4-二乙酰藤黄酚(2,4-diacetylphloroglucinol,DAPG)、吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylic acid,PCA)、藤黄绿菌素(pyoluteorin,Plt)、硝吡咯菌素(pyrrolnitrin,Prn)和氰化物等。

 

  Plt是一种芳香族聚酮类假单胞菌代谢产物,其生物合成途径及调控网络已有多篇文献报道。本文系统综述了Plt的化学结构和产生菌、合成基因簇、生物合成途径以及近年来调控机制方面的研究进展,为进一步推动Plt相关的基础与应用研究提供参考。

 

1  Plt的化学结构和产生菌

  Plt最早由Takeda等从铜绿假单胞菌T359和IFO3455产生的代谢产物中分离和鉴定,化学名称为2,3-二氯-5-[2′,6′-二羟基苯甲酰基]吡咯,分子式为C11H7O3NCl2。Plt常温下为黄色晶体,溶于乙酸乙酯、甲醇、环季胺等有机溶剂,微溶于水,紫外最高吸收峰在310 nm左右。芳香环作为吸电子基团对于Plt的抗菌活性是必须的;吡咯基团上的氯被溴或碘取代会显著降低对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和大肠杆菌(Escherichia coli)的抑菌活性,但被硝基取代可以增加Plt的抑菌活性。目前报道的Plt产生菌大都从植物根际分离得到,多数为防御假单胞菌和铜绿假单胞菌,少数恶臭假单胞菌也产生Plt(表1)。最近,Lacerna等从一株海洋铜绿假单胞菌中分离到了3个新的Plt结构类似物mindapyrroles A-C。


表 1  已报道的藤黄绿菌素产生菌株

产生菌株

分离株

报道详情

铜绿假单胞菌

T359和IFO3455

抑制人结核分枝杆菌M. tuberculosis hominis和原生动物

S10B2

有效防治马铃薯晚疫病、黄瓜霜霉病以及旱地条件下的杂草

FP6

用特异性引物PCR扩增验证含有Plt

M18

防治终极腐霉Pythium ultimum引起的棉花、甜菜立枯病

防御假单胞菌

PA1201

从培养液中提取并通过HPLC检测鉴定Plt

Pf-5、CHA0

抑制终极腐霉

S272、UP61、YGJ3、FD6

从培养液中提取并通过HPLC检测鉴定Plt

Pf373、WB52、MP12

PCR扩增pltB验证含有Plt

TY1508、KM2404、KY4410、TY1502、TM1109、RS-9

PCR扩增pltC验证含有Plt

Pf4、H78

基因组测序表征含有Plt生物合成基因簇

恶臭假单胞菌

NH-50

HPLC检测及PltB基因扩增

 
2  Plt生物合成途径

  Plt生物合成基因簇包括:Plt合成基因操纵子pltLABCDEFG、Plt转运操纵子pltIJKNOP、调控基因pltRpltZpltM。Plt由间苯二酚环和二氯吡咯基团组成,它们分别通过聚酮化合物生物合成途径(PKS)和非核糖体多肽生物合成途径(NRPS)合成。脯氨酸是Plt二氯吡咯部分的合成前体,首先通过氨基酸激活酶PltF将脯氨酸激活为L-脯氨酰-AMP,然后将其连接到载体蛋白PltL的磷酸泛酰臂上;再通过FAD依赖脱氢酶PltE识别脯氨酰部分,该酶将脯氨酸氧化为相应的吡咯基。PltA是黄素依赖性卤化酶,在N末端有保守的FAD依赖性卤化酶的结构域,C末端则有一个独特的螺旋区域与吡咯基-S-PltL底物结合,在4号位和5号位将吡咯基氯化得到二氯吡咯部分;随后,I-型聚酮合酶PltB和PltC利用丙二酰辅酶A单体使其碳链延长;PltG通过硫脂酶活性将延伸完全的聚乙酰底物和PltC的ACP结合域之间形成的硫酯水解,经由脱水反应形成间苯二酚部分,最终产生Plt。pltIJKNOP编码ABC-型转运复合体,负责将Plt转运至胞外。

 

高产Plt工程菌株构建及其应用潜力研究

  2011年许煜泉等将M18中pqsR基因敲除后得到基因工程菌株,Plt产量约为150 mg/L,比野生型发酵效价提高了3~4倍。Yan等将pltR中23种稀有密码子用同义的优选密码子取代,所得的突变体产生的Plt产量比野生型Pf-5高15倍。Shi等将假单胞菌H78中负调控Plt的rsmElonpltZ基因以及在pltR转录起始位点后12~42个碱基敲除,并且过表达Plt转运系统操纵子pltIJKNOP后,Plt产量提高14.3倍,达到214 mg/L。

 

  Plt对马铃薯晚疫病、黄瓜霜霉病、水稻胡麻斑病、柑桔溃疡病有防治效果,能抑制终极腐霉等植物病原菌。Hu等发现Plt对终极腐霉引起的棉花和甜菜立枯病具有很强的防治效果。最近的研究表明Plt可能是人类三阴性乳腺癌药物发现的潜在先导化合物。

 

  Zhang等发现可见光辐射对Plt稳定性没有明显影响,紫外线辐射大大缩短Plt半衰期至3~4 d,在黑暗中Plt半衰期为25 d。Plt在纯水溶液中和室温下相对稳定,半衰期超过20 d,酸性或碱性溶液会加剧其降解。董卉等建立了Plt土壤残留检测方法,发现Plt在地表土壤和根际土壤中的半衰期分别为42.26和32.84 h,表明Plt具有很好的生物安全性和环境兼容性,但也是Plt无法在土壤中维持长期有效生物防治效果的原因。Chen等利用负载二氧化硅药物的纳米材料制备了生物农药Plt的缓释配方,纳米结构的二氧化硅与Plt分子状态的结合对于大田应用具有很好的效果,克服了Plt在使用过程中生防功能迅速丧失的难题。

 

结论与展望

  Plt作为一种重要的假单胞菌代谢产物,其结构、生物合成机制和调控网络基本明确,在植物病害生物防治中的作用也得到广泛认可,但Plt相关的基础与应用研究需要在如下几方面进一步探究:① 生物合成机理还需要进一步完善,大部分合成酶的生化功能还有待验证。② 合成调控机制,尤其是PG-Cl2与PltR的结合如何激活pltL的表达,尚需进一步深入研究。是否还有更多的调控因子参与Plt基因簇的表达调控。③ Plt的产量偏低,目前的“高产”工程菌株Plt发酵效价无法满足产业化要求,导致生产成本高,影响其推广应用。④ Plt在土壤环境中稳定性不够好。可以通过合成生物学手段,引入修饰基因修饰Plt,合成更稳定和更高效的新产物。⑤ Plt 抑制植物病原菌生长的作用机理和作用靶标有待进一步研究。      (节选自:《中国生物防治学报》2020年10月网络首发版)

 

农药快讯, 2020 (21): 54-55.

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