近日，南京农业大学吴益东教授团队在重要国际学术期刊PLoS Genetics上发表题为genome mapping coupled with CRISPR gene editing reveals a P450 gene confers avermectin resistance in the beet armyworm的最新研究成果。该研究构建了首个高质量染色体水平的甜菜夜蛾参考基因组，通过基因克隆、基因编辑和体外功能表达等多种手段揭示了甜菜夜蛾细胞色素P450氧化酶通过单个氨基酸突变对阿维菌素类杀虫剂产生抗性的新机制。

　　害虫抗药性是农业生产的全球性制约因素之一，快速鉴定抗药性基因对于抗性害虫种群的监测和治理至关重要。细胞色素P450是昆虫体内一类重要解毒代谢酶，昆虫能够表达P450解毒酶，使害虫对杀虫剂产生抗性。每种昆虫具有100个左右的P450基因，因此P450抗性基因的鉴定和抗药性机制解析极具挑战性。

　　甜菜夜蛾是一种间歇性暴发成灾的全球性害虫，由于长期依靠喷洒杀虫剂进行防治，该害虫已对包括阿维菌素在内的多种杀虫剂产生了高水平抗药性。为了破译甜菜夜蛾对阿维菌素产生抗性的分子机制，本研究首先利用Illumina和PacBio测序技术获得了甜菜夜蛾染色体水平基因组，并构建遗传作图群体将抗性基因定位于在17号染色体15～16 Mbp区间、由9个CYP9A亚家族P450基因首尾相连组成的基因簇（图1）。

图 1  （A）组装了高质量、染色体水平的甜菜夜蛾参考基因组（B）通过全基因组扫描定位阿维菌素抗性基因基因簇

　　为了确定抗性基因，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术对甜菜夜蛾抗性品系体内长达130 kb的CYP9A基因簇进行整体敲除和分段敲除，通过反向遗传证据锁定了该基因簇中CYP9A186基因与甜菜夜蛾对阿维菌素的高水平抗性具有因果关系（图2）。

图 2  采用CRISPR/Cas9基因编辑技术对抗性品系CYP9A基因簇分段敲除根据抗性表型

　　进一步分析发现，甜菜夜蛾抗性品系CYP9A186在底物识别区域SRS1中携带F116V突变。通过离体功能表达研究证实，CYP9A186野生型不能代谢阿维菌素，而CYP9A186突变型（F116V）获得了对阿维菌素的解毒代谢能力，从而使甜菜夜蛾抗性品系对阿维菌素产生高水平抗性（图3）。

图 3  昆虫Sf细胞表达及离体代谢证实CYP9A186通过F116V点突变获得对阿维菌素的解毒代谢能力

　　本研究运用基因编辑与遗传定位相结合的新策略，快速鉴定了介导杀虫剂抗性的P450基因，明确P450基因通过功能获得性突变（gain of function mutation）导致害虫抗药性发生的分子机制。该研究成果不仅为甜菜夜蛾代谢抗性基因监测预警、抗性治理策略制定以及新型杀虫剂研发提供重要依据，同时为昆虫抗药性新基因的快速鉴定提供了一套可复制的解决方案。

　　南京农业大学植物保护学院吴益东教授、杨亦桦教授为论文共同通信作者，左亚运博士为第一作者，张峰教授、施雨博士、管放博士、张建鹏博士生以及丹麦哥本哈根大学René Feyereisen教授和美国干旱地区农业研究中心Jeffrey A. Fabrick研究员参与了此项研究。该研究得到了国家自然基金项目和国家科技基础资源调查计划项目的资助。    （来源：南京农业大学植物保护学院）

农药快讯, 2021 (11): 4.